土壤微生物檢測(cè)對(duì)土壤微生物進(jìn)行研究的方法

在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，在土壤微生物檢測(cè)土壤中生活有數(shù)量龐大的微生物種群，包括原核微生物如細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、放線菌及超顯微結(jié)構(gòu)微生物, 以及真核生物如真菌、藻類( 藍(lán)藻除外) 、地衣等。它們與植物和動(dòng)物有著明確的分工，主要扮演“分解者”的角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學(xué)反應(yīng)。由于土壤微生物的復(fù)雜性、土壤本身的多變性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人們對(duì)土壤微生物多樣性的研究與動(dòng)、植物相比遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后。隨著多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸測(cè)序等現(xiàn)代生物學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,人們對(duì)土壤微生物多樣性有了更多的了解；高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展則為研究土壤宏基因組提供了大量數(shù)據(jù)，為直接探究土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)提供了客觀而全面的信息。
1、土壤微生物檢測(cè)微生物平板培養(yǎng)法
傳統(tǒng)的土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)分析大多是將微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后通過(guò)一般的生物化學(xué)性狀，或者特定的表現(xiàn)型來(lái)分析，局限于從固體培養(yǎng)基上分離微生物。這種方法只限于極少量（0.1%-1%）可以培養(yǎng)的微生物類群，無(wú)法對(duì)絕大多數(shù)微生物的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的深入研究。
2、分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合測(cè)序的方法
在過(guò)去的20多年里，分子生物學(xué)技術(shù)，尤其16SrDNA技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于鑒定未知菌的研究中。20世紀(jì)80年代以來(lái), 逐步建立起了以分子系統(tǒng)發(fā)育分析為基礎(chǔ)的現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學(xué)的研究方法,使得研究者能夠在分子水平上對(duì)土壤微生物多樣性進(jìn)行研究。其中運(yùn)用比較廣泛并被普遍認(rèn)可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，檢測(cè)的DNA片段長(zhǎng)度范圍以200bp ～900bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測(cè)[4]，PCR 擴(kuò)增所需G/C 堿基對(duì)含量至少達(dá)40 % ，通常只能檢測(cè)到環(huán)境中優(yōu)勢(shì)菌群的存在，只有占整個(gè)群落細(xì)菌數(shù)量約1％或以上的類群能夠通過(guò)DGGE檢測(cè)到[5]。TGGE 儀器所允許的溫度范圍為15 ℃～80 ℃，較大片段DNA 的Tm 值因?yàn)榻咏?0 ℃而使檢測(cè)難度提高；若電泳條件不適宜，不能*保證將有序列差異的DNA片段分開，從而出現(xiàn)序列不同的DNA 遷移在同一位置的現(xiàn)象。
3、高通量測(cè)序方法
研究表明，400～600堿基的序列，足以對(duì)環(huán)境中微生物的多樣性和種群分類進(jìn)行初步的估計(jì)[8]，因此454高通量測(cè)序的方法因其讀長(zhǎng)（400~500bp）長(zhǎng)和準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)大量用于微生物多樣性的研究。有了微生物16S rDNA序列，不論是全長(zhǎng)還是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序與已知序列進(jìn)行相似性分析。Gen Bank將按照與測(cè)得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對(duì)應(yīng)的微生物種類，但更為的微生物分類還取決于系統(tǒng)發(fā)育分析高通量測(cè)序的*性體現(xiàn)在：測(cè)序序列長(zhǎng)，可以覆蓋16S /18S rDNA、ITS等高變區(qū)域； 測(cè)序通量高，可以檢測(cè)到環(huán)境樣品中的痕量微生物；實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)；無(wú)需進(jìn)行復(fù)雜的文庫(kù)構(gòu)建，微生物DNA擴(kuò)增產(chǎn)物可以直接進(jìn)行測(cè)序，實(shí)驗(yàn)周期短；測(cè)序數(shù)據(jù)便于進(jìn)行生物信息分析。該方法得到*期刊的認(rèn)可（Nature等），已成為土壤微生物多樣性檢測(cè)的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，為客戶提供的土壤樣本進(jìn)行高通量測(cè)序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。高通量測(cè)序因其數(shù)據(jù)量大，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，盡可能避免了繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程所造成的樣本損失，能夠相對(duì)客觀的反應(yīng)出土壤樣本的真實(shí)情況。